Extracto
Los biomarcadores que predicen la respuesta a la terapia dirigida en oncología son un componente esencial de la medicina personalizada. En estudios preclínicos de respuesta al tratamiento que ofrecieron modelos de tipo salvaje
KRAS
o mutante
BRAF
cáncer colorrectal tratados con cetuximab o vemurafenib, respectivamente, se expone que [
18 F] -FLT PET, una lectura de imagen molecular no invasiva de salvamento timidina, refleja fielmente las respuestas pro-supervivencia a la terapia dirigida que están mediadas por la actividad de PI3K-mTOR. La activación de los mecanismos de pro-supervivencia es la base de numerosos modos de resistencia. Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que [
18 F] -FLT PET puede servir un papel novedoso y potencialmente crítico para predecir los tumores que exhiben características moleculares que tienden a reflejar la obstinación de terapia de MAPK-dirigidos. Aunque estos estudios se centraron en el cáncer colorrectal, prevemos que los resultados pueden ser aplicables a otros tumores sólidos, así
Visto:. McKinley ET, Zhao P, Coffey RJ, Washington MK, Manning HC (2014) 3 ' desoxi-3 '- [
18 F] -Fluorothymidine TEP Refleja mediado por PI3K-mTOR favor de la supervivencia de respuesta a la terapia dirigida en el cáncer colorrectal. PLoS ONE 9 (9): e108193. doi: 10.1371 /journal.pone.0108193
Editor: Chunming Liu, de la Universidad de Kentucky, Estados Unidos de América
Recibido: 24 Febrero, 2014; Aceptado: August 24, 2014; Publicado: 23 Septiembre 2014
Derechos de Autor © 2014 McKinley et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Financiación de la investigación : R25 CA136440, K25 CA127349, CA128323 P50, P50 CA095103, CA092043 R25, R01 CA140628, CA145138 RC1, R01 CA046413, DK058404 P30, La Fundación Kleberg. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
con el aumento de capacidad para caracterizar rápida y económicamente la base genética del tumor de un paciente individual, terapias personalizadas se están convirtiendo rápidamente extendido en oncología. ejemplos emblemáticos del éxito de la medicina personalizada en oncología incluyen el uso de vemurafenib para tratar
V600EBRAF
melanoma [1] y trastuzumab para el tratamiento de
HER2
los cánceres de mama que sobreexpresan [2]. Con una creciente dependencia de las terapias molecularmente orientados, sigue existiendo un desafío igualmente crítico para desarrollar y validar biomarcadores específicos que reflejan la inhibición de destino, la inactivación de la vía, y predecir la respuesta clínica general. La mayoría de los biomarcadores utilizados en los estudios oncológicos requieren toma de muestras de tejido que es altamente susceptible a errores de muestreo y el sesgo debido a la heterogeneidad. biomarcadores basada en suero que carecen de la capacidad de visualizar directamente el tumor y demuestran que el efecto medido es directamente el resultado de la respuesta del tumor. de imagen no invasiva evita estas limitaciones y ofrece importantes ventajas sobre los biomarcadores tradicionales. De las modalidades de formación de imágenes clínicamente disponible, la sensibilidad y la capacidad de producir fácilmente moléculas biológicamente activas que llevan isótopos emisores de positrones hace que la tomografía por emisión de positrones (PET) una de las modalidades más atractivos para la detección de tumores y de perfiles de respuestas biológicas a la terapia.
Nuestro laboratorio ha estudiado la base biológica de la 3'-desoxi-3 '[18F] -fluorothymidine ([
18 F] -FLT) acumulación en tumores [3] - [6] y otros tejidos enfermos [7]. Un análogo de timidina, [
18 F] -FLT fue desarrollado originalmente para servir como una medida no invasiva de la proliferación celular, con la evidente utilidad en oncología [8], [9], informando sobre la ruta de recuperación de timidina que proporciona precursores de ADN a células en división. Tras la internalización celular, [
18F] -FLT se fosforila en una reacción catalizada por la enzima quinasa citosólica timidina 1 (TK1) y atrapado en la célula. actividad TK1 está estrechamente correlacionada con la síntesis de ADN y tiende a ser disminuido en células quiescentes. [
18 F] -FLT ha sido ampliamente estudiado como marcador de respuesta al tratamiento en un espectro de tipos de tumores y tratamientos tanto en la configuración pre-clínicos y clínicos [10]. Sin embargo, es importante tener en cuenta que a diferencia de marcadores de proliferación más generalizables, como Ki67, [
18F] -FLT PET refleja índices proliferativos a extensiones variables y potencialmente poco fiables [6], [11]. [
18 F] -FLT-PET no puede discriminar moderadamente proliferativa, timidina tumores de rescate impulsado desde las de los tumores de proliferación que se basan principalmente en la
de novo síntesis de timidina. A pesar de la falta de correlación con la proliferación en algunas circunstancias, se prevé que los niveles de TK1, y por lo tanto [
18 F] -FLT PET, podría reflejar otros eventos moleculares potencialmente importantes asociados con la respuesta al tratamiento.
El uso preclínico modelos de cáncer colorrectal que demuestran dos circunstancias en las que [
18 F] -FLT PET no se correlaciona con la proliferación, sino que más bien refleja la PI3K-mTor respuestas pro-supervivencia mediada a la terapia dirigida. En esta configuración, [
18 F] -FLT PET fue discordante 2-desoxi-2 - [
18F] fluoro-D-glucosa ([
18 F] FDG) PET, el trazador más ampliamente utilizado en oncología clínica, que no era sensibles a la actividad PI3K-vía mTOR- o. mediada por la inhibición de la actividad MAPK cetuximab en una de tipo salvaje
KRAS
modelo de línea celular y vemurafenib mediada por la inhibición de BRAF en un
V600EBRAF
modelo de línea celular mutante no tuvo efecto sobre [
18F] -FLT PET a menos de PI3K-mTOR se atenuó posteriormente farmacológicamente o
a través de
silenciamiento genético. En general, estos estudios demuestran un nuevo papel para [
18 F] -FLT PET como medio para predecir los tumores resistentes a la inhibición de la MAPK a través de la activación de PI3K-mTOR en el cáncer colorrectal y, potencialmente, otros tumores sólidos.
Materiales y métodos
líneas celulares y modelos de ratón
todos los estudios fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y uso de animales de la Universidad de Vanderbilt y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento de los animales. DiFi células humanas fueron un regalo del Dr. Bruce Boman [12] y COLO 205 se obtuvieron de la ATCC (CCL-222). células de cáncer colorrectal humano DiFi se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) y COLO 205 células fueron cultivadas en RPMI (Cellgro) con 10% de suero bovino fetal, (biológicos Atlanta), 1% de penicilina y estreptomicina (GIBCO) a 37 ° C y 5% de CO
2. C225 se obtuvo de la Vanderbilt Pharmacy, PLX4032 y PLX4720 se sintetizaron como se describe [13], PP242 se obtuvo de Sigma Aldrich, y BEZ235 de Selleck Chem. Las soluciones madre de cada fármaco se prepararon y se dividen en partes alícuotas para alcanzar concentraciones finales de fármacos para
in vitro
estudios in.
En
in vivo
estudios, xenoinjertos de líneas celulares fueron generados en atímicos desnudos los ratones (Harlan) como se describe [3] y el tratamiento se inició cuando el volumen alcanzó aproximadamente 150 mm
3. Para el tratamiento de xenoinjertos de DiFi, vehículo de solución salina, 20 mg /kg, o 40 mg /kg cetuximab se administraron i.p. cada tercer día. de formación de imágenes PET de cojinete de xenoinjerto de ratones DiFi se llevó a cabo 7 días después de la iniciación del tratamiento, 24 horas después del tercer tratamiento. Para COLO 205 xenoinjertos, los ratones se trataron con vehículo DMSO, 60 mg /kg PLX4720, o 40 mg /kg BEZ235 diariamente por sonda oral (100 l de volumen total). La PET de Colo ratones portadores de xenoinjertos 205 se llevó a cabo 4 días después del inicio del tratamiento, aproximadamente 24 horas después del tercer tratamiento. Los ratones fueron sacrificados inmediatamente después de la finalización de la PET.
métodos siRNA
Raptor (L-004107-00) y la secuencia aleatoria (D-001810-01) reactivos siRNA se obtuvieron de Thermo Scientific. siRNA se transfectó en células DiFi utilizando el kit de transfección DharmaFect (Thermo Scientific) según las instrucciones del fabricante. En resumen, 500.000 células DiFi se sembraron en cada pocillo de una placa de 6 pocillos. Después de 24 horas, siRNA se añadió a los pocillos apropiados. Después de 48 horas, vehículo de solución salina, 0,5 mg /ml o 5,0 g /ml C225 se añadieron a los pocillos apropiados. Después de otras 24 horas, se recogieron las células para la transferencia de Western y QRT-PCR como se describe a continuación.
síntesis de radiofármacos
[
18F] -FLT se preparó de una de dos pasos, reacción de una etapa como se describe [4], [14]. [
18 F] -FLT se obtuvo con una pureza radioquímica media del 98,3% y la actividad específica ≥345.5 TBq /mmol. [
18 F] FDG se sintetizó de la Universidad de Vanderbilt Medical Center Radiofarmacia y distribuido por PETNET. La pureza radioquímica medio del producto fue de 98,5% y la actividad específica fue de más de 37 TBq /mmol.
-Pequeño animales de imágenes
animal Pequeño imágenes de PET se realizó utilizando un escáner microPET dedicado ( Concorde Microsystems Focus 220). Los ratones se mantuvieron bajo anestesia de isofluorano al 2% en oxígeno a 2 L /min y se mantiene caliente a través de una resistencia de calentamiento de agua de circulación para la duración de la PET. Para [
18 F] animales de imágenes PET -FLT se administraron 7.4-9.3 200-250 MBq (Ci) por vía intravenosa. Animales se les permitió acceso libre a comida y agua durante un período de captación de 40 minutos, seguido de anestesia y una adquisición de imágenes 20 minutos. Para [
18 F] FDG PET de imágenes, los ratones se mantuvieron en ayunas durante aproximadamente 6 h antes de la imagen y se calentaron en una cámara calentada (31 ° C) durante 1 h antes de la [
18 F] FDG inyección y durante el período de absorción para minimizar la absorción de la grasa marrón de [
18 F] FDG. Los ratones fueron administrados 7.4-9.3 MBq de [
18 F] FDG por vía intravenosa y se dejó acceso libre al agua durante un período de captación de 50 minutos seguido de una adquisición PET 10 min.
se reconstruyeron los datos de PET utilizando OSEM3D /MAPA. Las reconstrucciones tridimensionales resultantes tenían un tamaño de vóxel X-Y de 0.474 mm y la distancia entre cortes de 0,796 mm. software ASIPro (Siemens) se utilizó para trazar manualmente regiones tridimensionales de interés en el volumen del tumor. Las muestras tumorales fueron recogidos inmediatamente después de [
18 F] -FLT-PET y flash congelado en nitrógeno líquido. [
18F] captación -FLT se cuantificó como el porcentaje de la dosis inyectada por gramo de tejido (% ID /g) dividiendo la actividad ROI por la dosis inyectada y multiplicando por 100.
en
in vitro
estudios, las células se lisaron con CelLytic M (Sigma Aldrich), se centrifugó a 16.000 rpm durante 15 minutos a 4 ° C, y el sobrenadante eliminado antes de la medición de la concentración de proteína por bicinconınico ácido (BCA) ensayo (Thermo Scientific). Para
in vivo
estudios, tejido fresco congelado se homogeneizó en CelLytic MT (Sigma Aldrich) tampón de lisis, se centrifugó a 16.000 rpm durante 15 minutos a 4 ° C, y el sobrenadante se retira antes de la medición de la concentración de proteína por BCA ensayo. Antes de la resolución por electroforesis, 20-40 g de proteína de cada muestra se cargó en 7,5 a 12% en geles de SDS PAGE y se transfirieron a membranas de PVDF (PerkinElmer). Las membranas se bloquearon durante la noche a 4 ° C en Tris-solución salina tamponada con 0,1% de Tween-20 (TBST) que contiene 5% w /v de leche descremada en polvo seco. Posteriormente, las membranas fueron interrogados con anticuerpos obtenidos de Señalización Celular Tecnología menos que se indique de p-ERK 1/2 Thr202 /Tyr204 (# 4370), ERK 1/2 (# 4372), TK1 (Abcam,#57757), p27 (# 3686 ), p-AKT Ser473 (# 4060), p-AKT Thr308 (# 4056), AKT (# 4685), p-rpS6 Ser236 /236 (# 4858), rpS6 (# 2217), p-4EBP1 Thr37 /46 (#2855), p-MEK Ser217 /221 (# 9154), MEK (# 9126), dusp6 (# 3058), β-actina (# 4970), β-tubulina (Novus Productos Biológicos,#NB600-936). Las membranas se sondaron durante 1 hora a temperatura ambiente en TBST con albúmina de suero bovino 3% (BSA). Las membranas se incubaron a continuación durante 1 hora a temperatura ambiente con peroxidasa de rábano picante conjugada con anticuerpo secundario (Jackson ImmunoResearch) diluido 1:5000 en TBST que contiene 3% de BSA. Western relámpago Plus-ECL (PerkinElmer) se utilizó para la detección quimioluminiscente en un Xenogen IVIS 200.
La inmunohistoquímica (IHC)
Los animales fueron sacrificados y las muestras de tumor se recogieron inmediatamente después de formación de imágenes PET, a continuación, posteriormente fija en 10% de formalina durante 24 horas. Los tejidos se transfirieron a continuación a 70% de etanol antes de la inclusión en parafina. Los tejidos se seccionaron (5 micras de espesor) y se tiñeron para p-rpS6 (Señalización Celular,#4858, 1:100 dilución principal), p-AKT Ser473 (Señalización Celular,#4060, 1:100 dilución principal), Ki67 (Dako,#M7240, 1:100 dilución principal), p27 (Dako,#M7203, 1:100 dilución principal). Brevemente, las muestras de tejido se de-con parafina, se rehidrataron, y la recuperación de antígeno se llevó a cabo usando tampón de citrato (pH 6,0) solución durante 15 minutos a 105 ° C seguido por un banco de 10 minutos se enfríe. Las muestras se trataron a continuación con peróxido de hidrógeno al 3% para eliminar la actividad peroxidasa endógena. Las secciones se bloquearon a continuación con un reactivo de bloqueo de proteínas libre de suero durante 20 minutos. la detección de anticuerpos primaria se realizó utilizando el siguiente sistema: Las secciones de tejido se incubaron a temperatura ambiente durante 60 minutos en las diluciones indicadas seguido de una incubación de 30 minutos utilizando el método de detección Polymer Envision + System-marcado con HRP (Dako, Carpinteria, CA). La tinción se completó después de la incubación con una solución de sustrato-cromógeno 3,3'-diaminobencidina. diapositivas de tejido se obtuvieron imágenes a un aumento de 40x y manualmente anotó para determinar el porcentaje de células positivas por campo de alta potencia.
QRT-PCR
ARN se recogió utilizando RNeasy según lo sugerido por el proveedor (QIAGEN) . Tanto cDNA y PCR en tiempo real los experimentos se llevaron a cabo utilizando el kit de síntesis de ADNc y iScript iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) por instrucciones del proveedor. Las amplificaciones se realizaron en un sistema en tiempo real BIO-RAD CFX96 durante 40 ciclos. Los datos fueron adquiridos por el software de Bio-Rad CFX Manager y pliegue cambios fueron analizados como se describe por Schefe et al [15]. TK1 humana (5'-AATCAGCTGCATTAACCTGCCCAC-3 'hacia adelante; 5'-ATCACCAGGCACTTGTACTGAGCA-3' inverso), P27 humana (5'-AGCAATGCGCAGGAATAAGGAAGC-3 'hacia adelante; 5'-TACGTTTGACGTCTTCTGAGGCCA-3' inverso) se obtuvieron de Integrated DNA Technologies. Análisis FODA
estadística
la significación estadística de los datos se evaluó mediante el no paramétrico de Wilcoxon de suma de rangos (Mann-Whitney U) pruebas utilizando el paquete de software GraphPad Prism 4. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas si p. & Lt; 0,05
Resultados
Reglamento de TK1 tras el bloqueo de EGFR de tipo salvaje
KRAS
células de cáncer colorrectal
Anteriormente , demostramos que las lecturas de imágenes de la ocupación de EGFR y la apoptosis, pero no [
18 F] -FLT PET, la respuesta a cetuximab en DiFi xenoinjertos de líneas celulares que expresan de tipo salvaje KRAS y EGFR presentan amplificación [3] predijeron, [12] . Por lo tanto, en este estudio, primero tratamos de dilucidar las relaciones entre el bloqueo de EGFR con cetuximab y regulación TK1. Inicialmente, se utilizó células DiFi cultivadas para evaluar la relación temporal entre la exposición cetuximab y p-ERK, TK1, y los niveles de proteína p27 de más de 24 horas (Fig. 1A). Como era de esperar, los niveles de p-ERK se atenuaron casi de inmediato, que muestra una reducción dramática en la primera hora de la exposición cetuximab (5,0 mg /ml), y que permanece bien por debajo de los niveles de referencia para un máximo de 24 horas. Paradójicamente, los niveles de TK1 aumentaron después de la exposición cetuximab, que alcanzó su punto máximo a las 12 horas, y luego se redujo rápidamente por debajo de los niveles de referencia. Los niveles de proteína de la p27 inhibidor del ciclo celular aumentaron dramáticamente y se estabilizaron por 12 horas. La relación inversa entre los niveles de proteína p27 y TK1 implicados p27 como un determinante clave de la regulación en las células TK1 DiFi.
(A) Western blot de lisados de células después de la exposición DiFi cetuximab (5 mg /ml) dio lugar a una rápida atenuación de los objetivos de MAPK aguas abajo incluyendo p-ERK, que permanecieron bien por debajo de los niveles basales a las 24 horas. Paradójicamente, los niveles de proteína TK1 aumentaron de 1-12 horas hasta que los niveles de proteína p27 de rosa, momento en el que la línea de base TK1 cayó abajo. las células (B) DiFi tratados con 0,5 mg /ml o 5,0 mg /ml cetuximab dieron como resultado una reducción del 50% y completa atenuación de los niveles de proteína p-ERK, respectivamente a las 24 horas. A 0,5 mg /mL TK1 niveles no se vieron afectados a pesar de un modesto aumento en los niveles de proteína p27. Sin embargo, 5,0 mg /ml cetuximab resultó en gran medida disminuyó TK1 con un gran aumento en los niveles de proteína p27. actividad PI3K-mTOR, medida por p-AKT Ser473, p-rpS6, y p-4E-BP1, se mantuvo una o elevada en 0,5 mg /ml cetuximab pero se atenuó a 5,0 mg /ml cetuximab. (C) QRT-PCR análisis mostró
TK1
ARNm se redujo significativamente a 0,5 mg /ml (p = 0,0279) y 5,0 mg /ml (p = 0,0186), mientras que ningún cambio en
p27
los niveles de mRNA se observó en ninguna de las dosis. (D) El silenciamiento mTORC1 facilitó la regulación positiva de p27 y atenúa los niveles de proteína TK1 a 0,5 mg /ml cetuximab sin afectar a los efectos de la actividad anti-MAPK de cetuximab. Los niveles de p-AKT Ser473, p-rpS6, y p-4E-BP1 se redujeron a 0,5 g /ml exposición cetuximab con Raptor desmontables pero no en el control de siRNA revueltos. (E) Como prueba de la funcionalidad de p27,
TK1
niveles de mRNA se redujeron de manera similar a 0,5 mg /ml y 5,0 mg /ml con Raptor caída.
Para evaluar más a fondo la relaciones entre la inhibición de la vía MAPK, la regulación TK1, y p27, las células DiFi fueron expuestos a dos concentraciones (0,5 mg /ml y 5,0 mg /ml) de cetuximab durante 24 horas (Fig. 1B). A 0,5 mg /ml, los niveles de proteína TK1 no se vieron afectadas a pesar de p27 modestamente elevado y una reducción de aproximadamente 50% de p-ERK y p-AKT Ser473. Por el contrario, el nivel de 5,0 mg /ml de la exposición dio como resultado niveles de TK1 en dramáticamente atenuados. Similar al tiempo de estudio, la reducción de TK1 correlacionado con un fuerte incremento de la p27. Además, se observó atenuación completa de p-ERK y p-ATK Ser473 a 5,0 g /ml. En contraste con la proteína,
TK1 ARNm
tendían a seguir los niveles de p-ERK más directamente (Fig. 1C), lo cual no es sorprendente dado
dependencia TK1 de búsqueda: 's en la transcripción E2F [16], un producto derivado de la actividad MAPK. Curiosamente,
p27
ARNm no se vio afectada por la exposición cetuximab, lo que sugiere que los niveles elevados de proteínas p27 se derivaron de la inhibición de abajo objetivos que afectan a la modificación post-transcripcional de p27, con AKT suelen ser uno de ellos [17]. Para determinar si los niveles de proteína TK1 observaron a 0,5 mg niveles /mL de la exposición se mantiene a través de una mayor eficiencia de traducción, que mide p-rpS6 y los niveles de p-4E-BP1, ambos productos de la actividad de PI3K-mTOR pro-translacional (Fig. 1B) . Se encontraron niveles de p-RPS6 a ser atenuadas sólo a la mayor concentración de cetuximab. Por otra parte, los niveles de p-4E-BP1 fueron elevados a la concentración más baja de cetuximab, lo que sugiere un mayor potencial para la traducción en la tapa ribosomal [18]. Tomados en conjunto con los
TK1
niveles de ARNm, estos resultados pueden sugerir que la eficiencia de traducción de TK1 en el nivel más bajo de la exposición cetuximab probable que proceder a través de la activación de mTOR.
Silenciar facilita la actividad de mTOR-PI3K atenuación cetuximab mediada por los niveles de TK1 en células DiFi
para explorar el papel de mTOR en la regulación TK1 en este contexto, que silenció mTOR mediante siRNA de Raptor, un miembro esencial del complejo mTOR funcional 1 (mTORC1) [ ,,,0],19]. En la ausencia de actividad mTORC1, los niveles de proteína TK1 fueron atenuados en ambos /ml y 5,0 g /ml concentraciones 0,5 g de cetuximab, sin un efecto obvio sobre la actividad vía MAPK (Fig. 1D). Como era de esperar, Raptor silenciamiento resultó en una mayor atenuación cetuximab mediada de p-AKT y p-Ser473 rpS6 así como el bloqueo de la fosforilación de 4E-BP1. Además de los niveles de proteína atenuada TK1, mTORC1 inactivación consecuencia un aumento de los niveles de proteína p27 que parecían ser al menos parcialmente responsable de
TK1
regulación transcripcional en el nivel más bajo de la exposición cetuximab (Fig. 1E). Curiosamente, como se ha observado anteriormente, el aumento de los niveles de proteína p27 no era en sí mismo un producto del aumento de la
p27
transcripción (Fig. S1). Estos resultados sugieren que la activación de mTOR imparte su efecto sobre TK1 a través de efectores corriente abajo, tales como AKT y ERK través de la modificación post-traduccional y la degradación de los inhibidores del ciclo celular, incluyendo p27 [17]. Como prueba de ello, la inhibición mTORC1 en conjunción con el bloqueo de EGFR condujo a una profunda reducción de los niveles de proteína TK1 no observables con la exposición cetuximab sola a la concentración más baja.
[
18 F] -FLT PET refleja la inhibición de la la actividad de PI3K-mTOR en el cetuximab tratados DiFi xenoinjertos de líneas celulares
in vivo
Estamos posteriormente Imaged DiFi xenoinjerto de ratones portadores con [
18 F] -FLT PET después del tratamiento con cetuximab (20 mg /kg o 40 mg /kg) o vehículo de solución salina. De acuerdo con nuestros estudios anteriores [3], similar [
18 F] se observó acumulación -FLT en xenoinjertos tratados con vehículo o 20 mg /kg cetuximab. El aumento de la dosis de cetuximab a 40 mg /kg resultó en disminuido [
18F] acumulación -FLT (Fig. 2A). Se observaron niveles de proteína TK1 disminuidos en la 40 mg /kg de dosis con respecto al vehículo y con los tumores 20 mg /kg cetuximab tratada (Fig. 2B). Similar a
in vitro
estudios, los niveles de proteína TK1 disminuido correlacionados con la proteína p27 elevada, pero no
p27
niveles de mRNA (Fig. S2). Adicionalmente, p-AKT Ser473 niveles de proteína tumor se aumentaron con la dosis de 20 mg /kg en comparación con el vehículo y 40 mg /kg cetuximab. los niveles de proteína TK1 no se vieron afectados por la dosis más baja de cetuximab, a pesar de la reducción significativa
TK1
mRNA (Fig. 2C), que se reduce con relación a los controles tratados con vehículo en ambos niveles de exposición cetuximab. IHC de los tejidos de xenoinjerto de imagen emparejados ilustra que la actividad de PI3K-mTOR, medido por p-rpS6 y P-Akt niveles Ser473, fue inhibida a la mayor exposición cetuximab (Fig. 2D, Fig. S3). Curiosamente, Ki67 se redujo en ambos niveles de exposición cetuximab (Fig 2D, Fig. S4), lo que sugiere que [
18F] -FLT PET se desacopla de las medidas estándar de proliferación en la dosis más baja. Mientras que [
18 F] -FLT PET parecía ser sensible a la actividad de PI3K-mTOR, [
18 F] FDG PET imágenes no fue sensible a este fenómeno. Nos observó reducción [
18 F] FDG captación relativa a los controles del vehículo, tanto a nivel de la exposición cetuximab (Fig. S5). En general, estos resultados sugieren que [
18 F] -FLT PET proporciona información única respecto de señalización mTOR que no está capturado por [
18 F] FDG PET o las medidas estándar de proliferación Ki67, como IHC.
xenoinjertos de tumores DiFi fueron imágenes en día 7 de 20 mg /kg o 40 mg /kg los regímenes de tratamiento con cetuximab. (A) [
18 F] -FLT PET se redujo sólo en xenoinjertos DiFi tratados en el /kg nivel de 40 mg (p = 0,0012). (B) Análisis de transferencia Western de los tejidos cosechados inmediatamente después de la impresión confirmó que los niveles de proteína TK1 solamente se redujeron en el nivel de dosis de 40 mg /kg. Se observó un aumento en los niveles de proteína p27 en los niveles de dosis 40 mg /kg. Se observó un aumento en los niveles de proteína p-AKT Ser473 en el nivel de dosis de 20 mg /kg. (C) De manera similar a
in vitro
observaciones,
TK1
ARNm se redujo significativamente en ambos de 20 mg /kg (p = 0,0009) y 40 mg /kg (p = 0,0001) Los niveles de dosis. (D) IHC análisis de p-rpS6 y p-AKT Ser473 mostró un poco elevado los niveles de tinción a 20 mg /kg. Sin embargo, ambos marcadores se redujeron en gran medida a 40 mg /kg. inmunoreactividad Ki67 se redujo en ambos niveles de exposición al cetuximab.
niveles de proteína TK1 no reflejan
inhibición V600EBRAF en células COLO 205
De forma análoga al modelo DiFi tratados con cetuximab, se evaluaron las relaciones entre la inhibición de destino, efectores aguas abajo, y los niveles de TK1 en un
V600EBRAF línea celular que expresa, COLO 205, se trata con un selectiva
inhibidor V600EBRAF (Fig. 3). exposición PLX4032 durante 48 horas dio lugar a la inhibición dependiente de la concentración de los niveles de p-MEK. Paradójicamente, los niveles de p-ERK se aumentaron de una manera dependiente de la concentración, excepto en la dosis más alta (5 M) (Fig. 3A). La falta de correspondencia entre p-MEK y ERK-P no se observó en la duración de la exposición de 2 horas (Fig. S6) o 24 horas (Fig. S7). Aunque los niveles de p-AKT Ser473 se redujeron sólo moderadamente con la exposición PLX4032 a las 48 horas, se observó un aumento dependiente de la concentración en p-rpS6 que se correlaciona con el aumento de p-ERK. Al mismo tiempo el aumento de p-rpS6 y niveles disminuidos dusp6 sugieren que el aumento de p-ERK fue al menos parcialmente el resultado de la actividad de fosfatasa disminuida que probablemente estaba relacionada con la activación de mTOR [20]. exposición PLX4032 condujo a un aumento modesto en los niveles de proteína p27. los niveles de TK1 se incrementaron ligeramente en concentraciones PLX4032 más bajos y sin cambios de vehículo en los niveles más altos de exposición, excepto para la concentración más alta (5 M). Sorprendentemente,
TK1
niveles de mRNA parecía estar más estrechamente asociada con la inhibición de p-MEK y, a diferencia de los niveles de proteína TK1, se redujeron de una manera esencialmente dependiente de la concentración (Fig. 3B).
COLO 205 células se recogieron 48 horas de PLX 4032 exposición a 10 nM, 100 nM, 500 nM, 1 mM, o 5 mM. (A) Análisis de transferencia Western mostró una inhibición blanco de p-MEK pesar del aumento de los niveles de p-ERK. PI3K-mTOR se elevó de una manera dependiente de 4032 PLX como exhibida por un aumento constante en los niveles de p-RPS6. El dusp6 ERK-fosfatasa se redujo en relación con la señalización de mTOR y fue inversamente proporcional a los niveles de p-ERK. Un ligero aumento en los niveles de p27 se observaron de forma concomitante con sólo cambios modestos en los niveles de TK1, excepto en la dosis más alta de PLX4032. (B) Disminución
se observaron TK1
niveles de mRNA en todas las concentraciones de la droga por encima de 10 nM (p & lt; 0,05).
[
18 F] -FLT PET, pero no [ ,,,0],
18 F] FDG PET, refleja la actividad mTOR elevado y se correlaciona con la falta de inhibición de p-ERK en PLX4720 tratados COLO 205 xenoinjertos
ratones portadores de xenoinjertos de COLO 205 fueron tratados diariamente con 60 mg /kg PLX4720 durante 4 días y fotografiado con [
18 F] -FLT PET o [
18 F] FDG PET (Fig. 4). De acuerdo con
in vitro
estudios que muestran que la inhibición de BRAF tuvo poco efecto sobre los niveles de TK1 en células COLO 205, el tratamiento con PLX4720 tuvo poco efecto en [
18 F] -FLT de imágenes PET. A la inversa, [
18 F] FDG PET se redujo significativamente en cohortes tratadas de manera similar (Fig. 4B). De acuerdo con las imágenes, los niveles de TK1 de xenoinjertos tratados con PLX4720 fueron similares a los controles tratados con vehículo. También similar a
in vitro
estudios, hemos encontrado niveles elevados de p-ERK y los niveles de p-RPS6 en PLX4720 xenoinjertos relación con los controles tratados con vehículo tratados, a pesar de la inhibición del efector BRAF, p-MEK.
(A) transversal Representante [
18 F] -FLT y [
18 F] FDG PET imágenes adquiridas después de tres tratamientos diarios con vehículo o 60 mg /kg PLX4720 (tumor indicado por la punta de flecha). (B) Cuantificación de los datos de PET ilustrada [
18 F] captación -FLT similar en los tumores tratados con vehículo y tratados con PLX4720. A diferencia de [
18F] -FLT PET, exposición PLX4720 provocó una reducción significativa en la [
18 F] FDG captación (p = 0,0006). (C) Análisis de transferencia Western de tejido de tumor tratados con vehículo y PLX4720-confirmado que PLX4720 no tuvo efecto sobre los niveles de proteína TK1 de acuerdo con [
18F] -FLT PET. Orientar la inhibición medida por los niveles de p-MEK se observó. Sin embargo, similar a
in vitro
estudios, tratados con PLX4720 COLO 205 xenoinjertos mostraron p-ERK y la proteína P-rpS6 niveles elevados en relación con los controles del vehículo.
Reglamento de TK1 siguiente mTOR o la inhibición dual de PI3K-mTOR y
inhibición V600EBRAF en células COLO 205
Para examinar el papel de mTOR en la regulación TK1 siguiente
inhibición V600EBRAF, cultivadas células COLO 205 fueron tratados concomitantemente con 250 nM pp242, un selectiva inhibidor mTORC1 /mTORC2 [21] y concentraciones crecientes de PLX4032 durante 48 horas (Fig. 5). Adición de PP242 tuvo poco efecto sobre la inhibición PLX4032 dependiente de p-MEK, sin embargo, efectivamente bloqueado activación de p-AKT en Ser473 y la activación romo previamente observada de p-rpS6 causada por la exposición PLX4032 (comparar con la Fig. 3A). Sin embargo, el bloqueo de mTOR era insuficiente para atenuar p-ERK o los niveles de p-AKT Thr308 de una manera dependiente de PLX4032, ni para atenuar por completo los niveles de p-RPS6 (Fig. 5A). Al igual que con un solo agente
in vitro
estudios, la activación de p-rpS6 correlacionado con una ligera atenuación de los niveles dusp6 y una ligera elevación de p-ERK en concentraciones más altas PLX4032. Sin embargo, la inhibición combinada de p-AKT Ser473 y p-MEK resultó en dramáticamente disminuyó TK1, tanto a la proteína y el nivel de mRNA. En presencia de p27 elevada,
TK1
niveles de mRNA cayó dramáticamente, con reducciones significativas observadas en concentraciones tan bajas como PLX4032 10 nM (Fig. 5A). Además, lo que sugiere que la actividad de AKT era responsable de la modificación post-traduccional y la degradación de p27, en presencia de la inhibición de p-AKT Ser473, la proteína p27 fue elevado dramáticamente pero
p27
mRNA no fue (Fig. 5C).
(A) Western blot de células COLO 205 tratadas con PP242 (250 nM) y el aumento de PLX4032. Similar a un solo agente PLX4032, p-MEK, pero no p-ERK, se inhibió de una manera dependiente de PLX4032. En consonancia con la inhibición mTORC1 /mTORC2, p-AKT Ser473, pero no p-AKT Thr308, se inhibió. A diferencia de un solo agente PLX4032, lo que resultó en la activación dependiente de la concentración de p-rpS6, tratamiento mantenido los niveles de p-RPS6 combinados a nivel de línea de base, esencialmente, excepto a la concentración más alta PLX4032. Del mismo modo, los niveles de dusp6 fueron inversamente proporcionales a los niveles de proteína p-ERK. Con mTOR combinado y
bloqueo V600EBRAF, p27 y la proteína TK1 niveles estaban inversamente correlacionados y dramáticamente afectados por la exposición PLX4032. (B) Del mismo modo,
TK1
ARNm se redujo significativamente en concentraciones tan bajas como PLX4032 10 nM. (C) A pesar de los niveles de proteína p27 elevados,
p27
ARNm no se vio afectada por la inhibición mTOR-
V600EBRAF combinado.
Teniendo en cuenta que
inhibición de mTOR-V600EBRAF combinado fue insuficiente para atenuar p-rpS6, y junto con la observación de que la actividad de PI3K y la señalización aguas abajo se ha propuesto como un mecanismo de resistencia a la inhibición de BRAF en el cáncer colorrectal [22] y el melanoma [23], [24], se evaluaron los efectos de la doble la inhibición de PI3K-mTOR en las células COLO 205 en conjunción con
inhibición V600EBRAF (Fig. 6). COLO 205 células fueron tratados con PLX4032, BEZ235, una pequeña molécula inhibidor dual de PI3K y mTOR [25], o la combinación durante 24 horas. De hecho, la inhibición de tanto la actividad de mTOR, medido por p-AKT Ser473, y la actividad de PI3K, medida por p-AKT Thr308, en presencia de PLX4032 resultado en los niveles de proteína p27 mayores y la disminución de los niveles de proteína TK1. Estos resultados llevaron a nuestra evaluación de esta combinación
in vivo
.
Un único agente PLX4032 dio lugar a la activación de p-AKT Ser473 tras 24 horas de exposición a dos concentraciones (100 nM, 1 M).